Potensi Sinamaldehid : hasil isolasi minyak kayu manis sebagai senyawa antidiabetes

       Senyawa kafeat dan sinamat telah dilaporkan memberikan khasiat inhibitor α-glukosidase. Penghambatan α-glukosidase pada usus mamalia mampu menurunkan kadar gula darah dari hasil metabolisme karbohidrat sehingga mampu menyebabkan pengurangan hiperglikemia postprandial untuk mencegah komplikasi kronis dari Diabetes Millitus (DM). Berdasarkan struktur kafeat dan sinamat, maka dari segi kimia organik maupun pertimbangan ekonomi dapat ditawarkan sebuah alternatif untuk mendapatkan turunannya dengan memanfaatkan minyak kayu manis yaitu sinamaldehid. Sinamaldehid dapat dipisahkan dari minyak kayu manis dengan cara penambahan natrium bisulfit menghasilkan senyawa hasil adisi berupa garam yang mudah dipisahkan dari sistem campuran. Untuk mendapatkan aldehid kembali dapat dilakukan penambahan asam.

Elusidasi struktur sinamaldehid dilakukan dengan spektrofotometer infra merah dan kromatografi gas-spektroskopi massa. Uji aktivitas antidiabetes senyawa hasil dilakukan melalui pengukuran penghambatan α-glukosidase. Sinamaldehid hasil isolasi dari minyak kayu manis berupa cairan berwarna kekuningan dengan rendemen 42,67%, kemurnian 99,8723 %. Elusidasi struktur sinamaldehid hasil isolasi menggunakan spektrofotometer infra merah (FTIR) diperoleh serapan gugus karbonil pada daerah 1676 cm-1, C-H aldehid pada daerah 2813,9 cm-1 dan 2742,6 cm-1. Hasil spektra massa sinamaldehid diperoleh M+ 132 dengan pola fragmentasi utama m/z 131,103, 77, dan 51. Uji aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase diperoleh konsentrasi penghambatan sebesar 93,29% pada konsentrasi 50 ppm, dengan IC50 27,96 ppm.

Pendahuluan 
       Penyakit Diabetes millitus adalah penyakit gangguan metabolisme kronis dengan multi etiologi yang ditandai dengan tingginya kadar gula darah/hiperglikemia disertai dengan gangguan metabolisme karbohidrat, lipid dan protein sebagai akibat insufisiensi fungsi insulin (Sowers, 2001). Tujuan utama dari pengobatan diabetes adalah untuk mempertahankan kadar gula darah dalam kisaran yang normal. Pengobatan diabetes meliputi pengendalian berat badan, olahraga dan diet. Tetapi kebanyakan penderita merasa kesulitan untuk melakukannya sehingga biasanya diberikan terapi sulih insulin atau obat hipoglikemik peroral. Obat hipoglikemik biasanya mengandung senyawa-senyawa yang bisa menghambat kerja enzim α-glukosidase yang berperan dalam pemecahan karbohidrat menjadi gula darah (Hanefeld, 2007).
       Penghambatan α-glukosidase pada usus mamalia mampu menurunkan kadar glukosa darah dari hasil metabolisme polisakarida atau oligosakarida. Perlambatan penyerapan glukosa darah menyebabkan pengurangan hiperglikemiapostprandial untuk mencegah komplikasi kronis dari Diabetes Millitus (DM) seperti retinopati, nepropati, neuropati dan masalah mikrovaskuler serta makrovaskular (Shibano, et al., 2008). Senyawa yang dapat berperan sebagai penghambat aktivitas α-glukosidase adalah senyawa kafeat (Matsui, et al., 2004), sinamat (Adisakwattana, et al., 2007). Berdasarkan struktur molekul kafeat dan sinamat mempunyai gugus fungsi alkena yang terkonjugasi dengan cincin benzene dan gugus karbonil. Disisi lain, tanaman dan minyak kayu manis dipakai sebagai pengobatan tradisional diabetes (Ping, et al., 2010). Komponen utama minyak kayu manis adalah sinamaldehid (42-75%), sedangkan komponen lain adalah eugenol, a-pinen, linalool dan benzaldehid (Prasetya and Ngadiwiyana, 2006; Mallavarapu,
et al., 1995). 
       Berdasarkan uraian di atas, sinamaldehid mempunyai gugus fungsi yang paling mirip dengan senyawa kafeat dan sinamat dibandingkan komponen minyak kayu manis yang lain sehingga diharapkan mempunyai kemampuan penghambatan aktivitas α-glukosidase

.
Gambar 1. Struktur molekul asam kafeat, asam
sinamat, dan komponen minyak
kayu manis.


























Metodologi
Bahan dan alat 
       Minyak kayu manis perdagangan, sedangkan NaHSO3 p.a., etanol p.a., eter p.a., HCl p.a., Na2SO4 p.a., DMSO, Na2CO3 p.a. diperoleh dari Merck, untuk α-glukosidase (EC.3.2.1.20 pH 7 t=37 °C), pnitrofenil
α-D-glukopiranosid, dan bovin serum albumin diperoleh dari Sigma-Aldrich. 
       Seperangkat alat refluks, set peralatan gelas, neraca analitik, rotary evaporator Buchii, GC-MS Shimadzu QP-5000, spektrofotometer UV-visible Shimadzu 1700, spektrofotometer IR Shimadzu PC-
8201, dan inkubator Memmet. 

Cara kerja Isolasi sinamaldehid 
       Sebanyak 100 g minyak kayu manis dimasukkan ke dalam gelas piala dan tambahkan 300 mL larutan natrium bisulfit jenuh sambil diaduk. Endapan yang terbentuk disaring dan dicuci dengan etanol dan sedikit eter. 
       Masukkan endapan hasil adisi bisulfit dan 250 mL larutan HCl 5% (b/v) ke dalam alat refluks. Campuran dipanaskan pada suhu 60 °C sambil di aduk sampai endapan larut semua dan terbentuk dua lapisan. Pisahkan kedua lapisan tersebut dengan menggunakan corong pisah. Larutan atas diekstrak dua kali dengan 25 mL eter. Lapisan eter disatukan dengan lapisan aldehid dan lakukan pencucian dengan air sampai didapatkan larutan yang netral. Setelah dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrous, larutan aldehid dalam eter dievaporasi. Residu yang diperoleh ditimbang dan dianalisis
dengan spektrofotometer IR dan kromatografi gasspektroskopi massa. 

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase 
Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1,0 mg a-glukosidase dalam 100 mL buffer fosfat (pH 7,0) yang mengandung 200 mg bovin serum albumin. Sebelum digunakan, sebanyak 1 mL larutan tersebut diencerkan 25 kali dengan buffer fosfat (pH 7,0) disebut sebagai larutan enzim. Sebanyak 250 mL 20 mM p-nitrofenil a-D-glukopiranosid sebagai substrat, kemudian ditambah 490 mL 100 mM buffer fosfat (pH 7,0) dan 10 mL larutan senyawa hasil sintesis dalam DMSO. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu optimum selama 5 menit, setelah itu ditambahkan 250 mL larutan enzim dan diinkubasi. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 1000 mL 200 mM natrium karbonat. Hasil reaksi adalah senyawa p-nitro fenol yang dapat diukur dengan menggunakan spektrofotometri UV-visibel pada panjang gelombang 400 nm. Sampel yang digunakan pada uji penghambatan a-glukosidase adalah sinamaldehid dengan variasi konsentrasi 6,25 ppm, 12,5 ppm, 25 ppm dan 50 ppm dengan pelarut DMSO. 
       Persen penghambatan dapat dihitung dari persamaan : [(C - S) / C] x 100; dengan S = absorbansi sampel (yang diperoleh dari S1 – So, dimana S1 = absorbansi sampel dengan penambahan enzim dan So = absorbansi sampel tanpa penambahan enzim) dan C = absorbansi kontrol (DMSO), tanpa sampel (kontrol-blanko). Nilai IC50 diperoleh dari: persamaan regresi linier Y = a + bx. IC50 -> Y = 50, kemudian disubtitusikan ke persamaaan regresi linier menjadi: IC50 = (50-a)/b.

Hasil dan Pembahasan
Isolasi sinamaldehid
       Sinamaldehid dapat dipisahkan dari minyak kayu manis dengan cara penambahan natrium bisulfit. Sinamaldehid mempunyai gugus fungsional aldehid yang reaktif terhadap adisi nukleofilik, salah satunya reaksi adisi natrium bisulfit terhadap ikatan rangkap C=O karbonil. Senyawa hasil adisi bisulfit merupakan garam yang mudah dipisahkan dari sistem campuran. Reaksi adisi ini bersifat dapat balik sehingga untuk mendapatkan aldehid kembali dapat dilakukan dengan penambahan asam sebagaimana disajikan pada gambar 2.
       Sinamaldehid yang dihasilkan diisolasi dengan ekstraksi pelarut menggunakan pelarut eter, kemudian dicuci dengan akuades sampai netral. Selanjutnya dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrous. Pelarut eter dihilangkan menggunakan rotary evaporator. Sinamaldehid yang diperoleh dengan rendemen 82%.
       Elusidasi struktur sinamaldehid dilakukan dengan menggunakan kromatografi gas-spektroskopi massa dan Spektrofotometer infra merah (Gambar 3). Dari data kromatografi gas- spektroskopi massa diperoleh bahwa kemurnian sinamaldehid hasil isolasi sebesar 99,8723%, spektra massa diperoleh M+ : 132 dengan pola fragmentasi pokok m/z : 131, 103, 77, 51 dan 29 (Friedman, et al., 2000).
       Dari spektrum tersebut terlihat pita 1676,0 cm-1 yang menunjukkan adanya serapan gugus karbonil (-C=O). Menurunnya harga frekuensi vibrasi rentangan gugus karbonil dibandingkan dengan harga normal karena gugus karbonil tersebut terkonjugasi dengan ikatan rangkap. Adanya ikatan –C=Cditunjukkan dengan serapan pada 1604 cm-1 yang diperkuat dengan adanya pita dekat 3028 cm-1 hasil dari serapan =C-H. Adanya cincin aromatis ditunjukkan dengan serapan pada daerah 1575 cm-1.Gugus -C-H aldehid ditunjukkan serapan pada daerah 2813,9 cm-1 dan 2742,6 cm-1 (Gende, et al., 2008).

Gambar 2. Reaksi isolasi sinamaldehid.

 Gambar 3. Spektra Infra Merah Sinamaldehid.

Gambar 4. Senyawa dengan gugus sinamoil.

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase

       Berdasarkan Matsui, et al., (2004) dan Adisakwattana, et al., (2007), menyatakan bahwa gugus yang berperan dalam penghambatan enzim a-glukosidase adalah gugus sinamoil. Komponen minyak kayu manis yang mengandung gugus sinamoil adalah sinamaldehid seperti disajikan pada gambar 4. Hal ini mendasari pemilihan sinamaldehid sebagai senyawa yang akan diuji penghambatan aktivitas enzim a-glukosidase. Uji ini merupakan uji pendahuluan terhadap senyawa yang berpotensi sebagai antidiabetes karena penghambatan enzim a-glukosidase mampu menurunkan kadar glukosa darah dari hasil metabolisme polisakarida atau oligosakarida. Biasanya obat antidiabetes mengandung senyawa-senyawa yang bisa menghambat kerja enzim α-glukosidase yang berperan dalam pemecahan karbohidrat menjadi gula darah (Hanefeld, 2007).

Gambar 5. Persamaan reaksi enzimatik a-glukosidase dan p-nitrofenil-a-D-glukopiranosid.
Gambar 6. Persen penghambatan terhadap enzim a-glukosidase dari sinamaldehid.













       Uji penghambatan terhadap enzim a-glukosidase dilakukan untuk mengetahui aktivitas antidiabetes dari setiap senyawa. Pada uji ini enzim a-glukosidase akan menghidrolisis substrat p-nitrofenil-a-Dglukopiranosid menjadi p-nitrofenol yang berwarna kuning dan glukosa dengan reaksi yang ditampilkan pada gambar 5 sebagai berikut : 
       Aktivitas enzim diukur berdasarkan hasil absorbansi p-nitrofenol yang berwarna kuning. Dengan adanya senyawa sinamaldehid dari kayu manis yang berperan sebagai inhibitor a-glukosidase maka p-nitrofenol yang dihasilkan akan berkurang yang ditandai oleh berkurangnya intensitas warna kuning.
       Pada Gambar 6 diperlihatkan persen penghambatan terhadap enzim a-glukosidase dari sinamaldehid pada konsentrasi 6,25 ppm, 12,5 ppm, 25 ppm dan 50 ppm. Dari gambar 6 dapat terlihat bahwa
sinamaldehid pada 50 ppm mampu menghambat enzim a-glukosidase sebesar 93,29%, dengan nilai IC50 sebesar 27,96 ppm. Nilai IC50 merupakan bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak (ppm) yang mampu menghambat 50% aktivitas enzim a-glukosidase. Menurut Reddy, et al., (1999) senyawa dikatakan aktif apabila mempunyai nilai IC50 dibawah 50 ppm, sehingga sinamaldehid mempunyai potensi yang baik sebagai senyawa penghambat aktivitas enzim a-glukosidase.

Kesimpulan 
       Sinamaldehid hasil isolasi dari minyak kayu manis mempunyai nilai IC50 sebesar 27,96 ppm terhadap enzim a-glukosidase sehingga sangat potensial sebagai senyawa penghambat aktivitas enzim a-glukosidase yang bisa dikembangkan sebagai senyawa antidiabetes.